用于通過 SDS-PAGE 分離磷酸化蛋白質(zhì)

Phos-tag^® Acrylamide

僅需將Phos-tag^® Acrylamide與丙烯酰胺溶液混合并聚合，即可生成用于分離磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)的Phos-tag^® SDS-PAGE。

在不使用放射性同位素的情況下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于 Western blotting 和質(zhì)譜分析等后續(xù)實驗。

Phos-tag™ SDS-PAGE 操作簡單，只需在常規(guī) SDS-PAGE 膠中加入 Phos-tag™ Acrylamide 和 Mn²⁺ 或者 Zn²⁺ 即可進(jìn)行實驗。在電泳過程中，磷酸化蛋白的磷酸基團(tuán)與 Phos-tag™ 中的二價金屬離子相結(jié)合，降低其遷移速度，從而可區(qū)分磷酸化與非磷酸化蛋白。

◆優(yōu)點、特色

● 采用 Phos-tag™ SDS-PAGE 可輕松分離磷酸化蛋白

無任何放射性元素及化學(xué)標(biāo)記！

● 不論氨基酸殘基的類型/位點如何，均可使用

可用于未知的磷酸化分析

可用于檢測新的磷酸化位點（無需購買商品化磷酸化抗體、無需特意制備磷酸化抗體）

● 磷酸化位點數(shù)量/位點不同的磷酸形式也可分離

顯示磷酸化程度和磷酸化形式

● 可同時檢測磷酸化/非磷酸化形式

可定量各種磷酸化形式

可簡單明確有無磷酸化

● 無需RI或特殊的儀器

實驗成本低，操作簡單。（SDS-PAGE的試劑→只要有設(shè)備即可使用）

● 電泳后可用于WB、MS分析，也可用于二維電泳

WB：可分析內(nèi)源性蛋白

MS：可顯示各磷酸化形式的磷酸化位點的組合

二維電泳：可分離相同等電點和分子量的磷酸化形式

適用于內(nèi)源性蛋白的磷酸化分析！

◆Phos-tag^® SDS-PAGE的原理

Phos-tag^® Acrylamide的結(jié)構(gòu)

1. 電泳中的磷酸化蛋白會被2個二價金屬離子捕獲

2. 磷酸化水平越高，電泳速度越慢

3. 根據(jù)磷酸化水平進(jìn)行分離（即使磷酸化位點的數(shù)量相同，只要位置不同也可進(jìn)行分離）

常規(guī)的SDS-PAGE（上圖：非Phos-tag^® 條件下）中，無法確認(rèn)底物是否被磷酸化。

◆案例、應(yīng)用

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】

“我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究科 小川覺之"

　　Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開發(fā)出來的試劑。此產(chǎn)品使用方便，不但可用于體外實驗，還能定量分析體內(nèi)蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常規(guī)電泳實驗，無需購買特殊設(shè)備，性價比高。傳統(tǒng)蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑，操作復(fù)雜，花費大，且放射性元素會有安全隱患，而 Phos-tag ™ 的出現(xiàn)恰恰可以彌補(bǔ)這些缺點，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖

　　Lane 1 為非磷酸化蛋白，Lane 2-5 為磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化狀態(tài)不同而條帶遷移率也有所不同。

　　磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數(shù)量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據(jù)條帶遷移和條帶濃度求得。

【資料提供】

日本東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科

【二維電泳中的應(yīng)用：分析 hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體】

　　小鼠巨噬細(xì)胞 J774.1 經(jīng) LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K 。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。

二維電泳

　　同一個等電點的位置上，不同位點發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【參考文獻(xiàn)】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【結(jié)果提供】

　　橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化學(xué)研究所 RCAI 小原收

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】

　　常規(guī) SDS-PAGE 和Phos-tag^TM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實驗分析 EGF 刺激的 A431 細(xì)胞中 MAPK 磷酸化水平。

摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

【使用示例：α-酪蛋白去磷酸化反應(yīng)隨時間的變化】

使用Phos-tag^® SDS-PAGE和常規(guī)SDS-PAGE分離堿性磷酸酶隨時間（孵育時間：0~120 min）去磷酸化的α-酪蛋白樣品。

◆相關(guān)產(chǎn)品

phos-tag™ 由日本廣島大學(xué)研究生院醫(yī)齒藥學(xué)綜合研究科醫(yī)藥分子功能科學(xué)研究室開發(fā)，對應(yīng)指導(dǎo)手冊請見相關(guān)資料。